Суть хроматографического процесса

Рассмотрим хроматографическую колонку. В простейшем исполнении она представляет собой трубку, заполненную сорбентом. Сорбент – это материал, обладающий уникальным свойством удерживать молекулы вещества на своей поверхности. Причем, как крепко и долго будет удерживаться вещество на сорбенте, зависит от свойств и самого вещества, и сорбента. Например, на активном угле с увеличением количества групп –СН₂–, т.е. с увеличением молекулярной массы, «удерживаемость» органического соединения будет также увеличиваться. Вещество, удерживаемое сорбентом, называют сорбатом. Сорбент в хроматографическом процессе будет являться неподвижной фазой. Исследуемое вещество увлекается потоком подвижной фазы.

Неподвижная фаза – это твердый сорбент или несмешивающаяся с подвижной фазой жидкость, на которых осуществляется различное удерживание и разделение компонентов смеси.

Подвижная фаза – поток жидкости, флюида или газа, перемещающий компоненты разделяемой смеси вдоль неподвижной фазы.

Данный поток жидкости, флюида или газа также называют элюентом, а выходящий из колонки поток подвижной фазы с компонентами разделяемой смеси веществ – элюатом. В газовой хроматографии подвижную фазу назвают также газом-носителем.

Совокупность двух несмешивающихся и движущихся друг относительно друга фаз (подвижной и неподвижной) называется хроматографической системой.

Одно из наиболее удачных определений хроматографии дал М. С. Вигдергауз, охарактеризовавший ее в первую очередь как процесс. Он писал: «хроматографическими следует называть процессы, основанные на перемещении вещества (газа, жидкости или совокупности надмолекулярных структур) вдоль пористого слоя или внутри ограниченного пространства в потоке, вызванном действием движущих и тормозящих сил, из которых, по крайней мере, одна зависит от молекулярной структуры или физико-химических свойств вещества».

В хроматографии обычно в качестве движущей силы выступает подвижная фаза, реже – электрическое поле (электрохроматография, капиллярный электрофорез). В качестве тормозящих сил могут выступать процессы сорбции (газо-адсорбционная и жидкостно-адсорбционная хроматография), растворения сорбатов в неподвижной жидкой фазе (газо-жидкостная и жидкостно-жидкостная хроматография), ионного обмена (ионная хроматография), проникновения молекул сорбата в поры сорбента различного размера (гель-проникающая или эксклюзионная хроматография). На рисунке 1 представлена простейшая хроматографическая система, в которой поток подвижной фазы увлекает молекулы сорбата, одновременно с этим тормозящие факторы удерживают их на поверхности или в объеме сорбента. Поскольку действие тормозящих сил зависит от структуры молекулы, то одни молекулы задерживаются в колонке дольше других и в итоге могут быть выделены в виде отдельных компонентов.

С помощью регулирования таких параметров, как температура хроматографического процесса, тип сорбента, тип и скорость движения подвижной фазы и др. можно добиться оптимального разделения многокомпонентной смеси. Фракции отдельных компонентов можно собрать для последующего использования (препаративная хроматография) или они могут быть "опознаны" с помощью компьютерной программы, определяющей химический состав вещества (аналитическая хроматография).

По современной номенклатуре, предложенной ИЮПАК, хроматография рассматривается не только как процесс, но и как наука, изучающая этот процесс, а также метод разделения сложной смеси, основанный на этом процессе.

Хроматография – это наука о межмолекулярных взаимодействиях и переносе молекул или частиц в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.
Хроматография – процесс дифференцированного многократного перераспределения веществ или частиц между несмешивающимися и движущимися относительно друг друга фазами, приводящий к обособлению концентрационных зон индивидуальных компонентов исходных смесей этих веществ или частиц.
Хроматография – метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.

Наиболее широко в настоящее время хроматография используется как метод анализа. С ее помощью выполняется более 60 % наиболее востребованных на сегодняшний день качественных и количественных анализов. С этой точки зрения проведенный хроматографический процесс должен ответить на два вопроса: «Какое вещество находится в смеси?» (качественный анализ) и «Сколько этого вещества в смеси?» (количественный анализ).

Ответ на первый вопрос мы получим, если воспользуемся характеристиками удерживания, на второй – откликом детектора на количество вещества. Обе эти характеристики мы найдем на хроматограмме (рисунок 2 и 3).

Хроматограмма – записанная во времени функция концентрации определяемых веществ в подвижной фазе на выходе из колонки.

Как мы уже знаем, разделение в хроматографии основано на различной сорбируемости анализируемых соединений при движении их по слою сорбента в колонке. Если соединение не сорбируется, то оно не удерживается сорбентом в колонке и будет выходить из колонки со скоростью потока газа-носителя. Если же вещества сорбируются, то они удержатся в колонке, это будет определяться их сорбционной способностью: чем сильнее сорбция соединения, тем дольше оно будет удерживаться в колонке. Параметры удерживания, по существу, характеризуют сорбционную способность анализируемых соединений. Различие в сорбируемости в конечном итоге определяется различием межмолекулярных взаимодействий вещество – сорбент.

Нулевая линия представляет собой сигнал детектора при концентрации сорбата в подвижной фазе, равной нулю. Время от момента ввода пробы в колонку до выхода максимума пика называется временем удерживания t_R. Оно складывается из двух составляющих: времени нахождения молекул соединения в газовой фазе и времени нахождения молекул соединения в сорбируемом состоянии. Время нахождения молекул исследуемого соединения в газовой фазе оценивают с помощью величины времени удерживания несорбирующегося вещества (мертвое время удерживания), которое зависит от доли пустот в насадочной или капиллярной колонке. В разных насадочных колонках плотность набивки может изменяться, будет также изменяться и величина t_М, поэтому для характеристики истинной удерживающей способности необходимо определять величину – приведенное время удерживания:

Величину t_М определяют по времени выхода несорбируемого соединения. В газовой хроматографии эту величину определяют по времени выхода гелия или водорода в случае применения детектора по теплопроводности и метана при использовании пламенно-ионизационного детектора.

Описанное выше время удерживания называют абсолютной характеристикой. Различают также относительные и интерполяционные величины удерживания.

Относительные величины удерживания рассчитываются относительно какого-либо вещества, взятого в качестве стандарта.

Точность определения относительных величин удерживания выше, чем абсолютных и не зависит от погрешности измерения скорости ПФ и количества НФ. Однако имеет место потеря информации об абсолютной величине удерживания.

Интерполяционные величины удерживания получают с использованием двух или более стандартных веществ сравнения, потому их точность выше, чем относительных. Логарифмический индекс удерживания Ковача (1958) – это безразмерный параметр, характеризующий удерживание сорбата в масштабе шкалы удерживания н-алканов, хроматографируемых в идентичных изотермических условиях:

где z и (z+1) – число атомов углерода в молекулах н-алканов, элюирующихся до и после исследуемого вещества х, т.е. t_R(z+1) > t_Rx > t_Rz. I – безразмерная величина, равная умноженному на сто числу атомов углерода в молекуле такого гипотетического н-алкана, который имел бы одинаковое с исследуемым веществом приведенное время удерживания. Линейный индекс удерживания, предложенный М.С. Вигдергаузом (1968), определяется следующим соотношением:

Он предложил более простое выражение, чем I, т.к. отсутствует необходимость определения t_М и логарифма приведенного времени удерживания. J – безразмерная величина, равная числу атомов углерода такого гипотетического н-алкана, который имел бы одинаковое с исследуемым веществом время удерживания.

Для определения количественного содержания анализируемого компонента в пробе используют следующие хроматографические сигналы: h – высота пика (перпендикуляр, опущенный из максимума пика на продолжение нулевой линии); Q – площадь пика, ограниченная его контуром и продолжением нулевой линии (рисунок 3). Площадь пика либо интегрируется при помощи специализированных программ, либо при использовании регистратора аналогового сигнала определяется оператором по площади треугольника как произведение высоты пика на ширину пика на половине высоты. Поэтому в идеальном случае строятся касательные по фронту и тылу пика.

Пик ограничивается фронтом, соответствующим возрастанию концентрации до максимальной и тылом, отвечающим убыванию концентрации сорбата в подвижной фазе. Расширение (размытие) полосы по мере элюирования характеризуется шириной пика: w_h – расстояние между точками пика на середине высоты; w_b – отрезок основания пика, отсекаемый двумя касательными в точках перегиба пика.

Высота и площадь хроматографического пика являются количественной интерпретацией отклика детектора на содержание вещества в подвижной фазе, выходящей из колонки. Причем, чем больше концентрация анализируемого вещества, тем больше величина высоты или площади пика. Поскольку чувствительность детектора меняется в зависимости от соединения, для проведения количественного анализа предварительно строят градуировочные зависимости, которые отражают зависимость сигнала детектора (высоты или площади пика) от концентрации или массы определяемого вещества. В большинстве случаев зависимость имеет вид:

где Q – площадь пика определяемого компонента, С – концентрация определяемого компонента в анализируемой смеси, К – градуировочный коэффициент (коэффициент чувствительности детектора к определяемому компоненту).

Градуировочный коэффициент находят, хроматографируя ряд смесей с известным содержанием определяемого компонента (градуировочных смесей или растворов).

Проведение качественного и количественного анализа, в том числе построение градуировочной характеристики, описывается в методиках выполнения хроматографических измерений, которые проходят соответствующую аттестацию.